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磷酸化多肽蛋白激酶活性分析分为两步

磷酸化多肽蛋白激酶活性分析分为两步:
 ?、倌┒吮昙堑娜姿岷塑蘸斯┨?通常是ATP,有时用GTP)中的磷酸基团转移到蛋白质或肽底物上;
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  前者通常在溶液中进行,(磷酸化多肽)酶和底物均在液相中。后者为了去除游离的标记核苷酸,通常需要用三氯醋酸沉淀、SDS-PAGE分离或使标记底物结合于纤维素膜上。
  有时可将酶或底物固定于固相载体上,如蛋白质混合物经SDS-PAGE后转移到硝酸纤维素膜上,然后封闭,放入含有酶和标记ATP的溶液中?;蛘吒徊剑杓埔桓龅鞍准っ阜治鱿低?酶活性的原位分析),将(磷酸化多肽)蛋白激酶和它的底物均固定于硝酸纤维素膜上,这一方法可与标准的液相分析方法达到相等的灵敏度和线性范围。其分析原理是含有蛋白激酶活性的样品先固定于硝酸纤维素膜上(点滴或真空抽吸),然后将滤膜浸入合适的蛋白底物溶液中,底物蛋白质与剩余的膜结合位点结合,然后加入同位素标记的ATP,作用一定时间后洗去膜上未反应的ATP并终止反应,参入物经放射自显影或液闪计数定量,与膜结合的酶和底物均具有一定的运动性,两者反应的定量值代表磷酸化的程度。

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